PETUNJUK

tentang penggunaan kit reagen untuk penentuan kolorimetri protein dalam urin dan cairan serebrospinal dengan pirogalol merah

Kit ini meliputi:

200 ml (2 x 100 ml P + 2 x 2 ml kalibrator)

500 ml (2 x 250 ml P + 2 x 5 ml kalibrator)

Prinsip metode

Ketika protein berinteraksi dengan pyrogallol merah dan

natrium molibdat membentuk kompleks berwarna,

yang intensitas warnanya sebanding dengan konsentrasi

Isi Kit

Reagen (P) - larutan merah pyrogallol dalam suksinat

buffer siap digunakan.

Kalibrator - Solusi Protein Kalibrasi Rendah (0,20

g / l, digunakan untuk menentukan mikroproteinuria) dan tinggi

(0,50 g / l, digunakan untuk menentukan proteinuria)

konsentrasi protein mengandung 70% albumin dan 30%

globulin siap digunakan.

Set penyimpanan - pada suhu 2-8 ° C dalam satu paket

produsen untuk seluruh umur simpan.

Stabilitas reagen dan kalibrator

Setelah dibuka, reagen stabil selama 6 bulan, kalibrator - 3 bulan. bila disimpan dalam bentuk tertutup rapat pada suhu 2-8 ° C di tempat gelap.

Nilai normal

• urin - hingga 0,120 g / l (hingga 0,141 g / hari);
• cairan serebrospinal (CSF) - 0,150-0,450 g / l.

Sampel untuk analisis

CSF air seni, tidak hemolisis.

Persiapan untuk analisis

1. CSF dan urin disentrifugasi selama 10 menit pada 2.700-4.000 rpm.
2. Gunakan tabung yang bersih dan dicuci dengan baik untuk analisis. Tes untuk kesesuaian tabung reaksi untuk analisis adalah tidak adanya perubahan warna dalam reagen. Jika reagen berubah menjadi biru tanpa menambahkan sampel, hasil penentuan protein akan ditaksir terlalu tinggi; Oleh karena itu, keluarkan reagen terlebih dahulu dan kemudian tambahkan urin.
3. Ketika mengatur metode, kuvet baru harus digunakan, karena mereka tidak diwarnai dengan reagen dan sampel reaksi. Cuvet plastik tua (keruh, tidak transparan) tidak cocok untuk pengukuran. Sebelum digunakan, perlakukan cuvette yang digunakan sebagai berikut: biarkan selama 10 menit dalam larutan pencuci (200 ml larutan hidrogen peroksida 5% atau 1 ml deterjen), kemudian bilas dengan keran dan air suling setidaknya 10 kali. Kit ini cocok untuk analisis pada analisa semi-otomatis dan otomatis biokimia.

Analisis Panjang Gelombang: 598 (578-620) nm; panjang jalur optik: 10 mm; suhu: 18-25 ° C.

Reagen dan kalibrator harus disimpan pada suhu kamar selama sekitar 30 menit sebelum analisis.

Prosedur 1 (penentuan proteinuria)

Sampel dicampur, disimpan selama 10 menit pada suhu kamar (18-25 ° C). Ukur kepadatan optik sampel eksperimental (E) dan kalibrasi (Ek) terhadap sampel kontrol (kosong). Warnanya stabil selama 1 jam.

APA YANG KITA MENGUKUR DALAM METODE SULFOSALYCYL URINE?

Di negara kami, metode turbidimetri menggunakan asam sulfosalisilat (metode sulfosalisilat), yang pertama kali diusulkan oleh Kingsbury F, terutama digunakan untuk menentukan konsentrasi protein dalam urin. B. dan rekan penulis pada tahun 1926. Pada saat yang sama, laboratorium negara-negara maju secara praktis tidak menggunakan metode ini, akibatnya kontrol kualitas laboratorium analisis protein urin menunjukkan penurunan koefisien variasi. Jadi pada tahun 1993, 60% laboratorium diagnostik klinis Perancis melakukan penentuan konsentrasi protein urin menggunakan metode kolorimetri menggunakan pewarna merah pyrogallol (metode pyrogallol) dan hanya 10% menggunakan metode sulfosalicylic. Kit diagnostik untuk menentukan protein urin berdasarkan metode pyrogallol diproduksi oleh perusahaan terkenal seperti Bayer D iagnostics, Beckman, Biodirect, Biocon Diagnostik, Laboratorium Bio-Rad, Eurodiag, Kone, Merck, Randox, Serono, Sentinel CH, Sigma. Sayangnya, di negara kita, karena alasan ekonomi dan sebagian karena kurangnya pengalaman, metode kolorimetri untuk menentukan protein urin masih digunakan sangat sedikit.

Timbul pertanyaan - bagaimana bisa dibenarkan penolakan laboratorium di negara maju dari menggunakan metode yang sederhana dan, yang paling penting, murah. Untuk mengklarifikasi masalah ini, kami membandingkan hasil penentuan konsentrasi protein dalam urin pasien dengan dua metode: sulfosalicylic [1] dan pyrogallol [2].

Prosedur untuk mengukur konsentrasi protein dengan masing-masing metode adalah sebagai berikut.

Reagen: larutan asam sulfosalisilat 3%, larutan natrium klorida 0,9%,

Calibrator (larutan kalibrasi albumin serum, 50 g / l, dalam larutan natrium klorida, 0,9% dan natrium azida, 0,095%) dari kit "Uni-Test - Total Protein" yang diproduksi oleh "Diakon DS" dengan urutan "A / Tentang Unimed ”.

Peralatan: spektrofotometer SF-2000 yang diproduksi oleh OKB "Spectr".

Kursus pengukuran: 0,5 ml urin yang disaring dan 1,5 ml larutan asam sulfosalisilat 3% ditambahkan ke kuvet kuarsa dengan panjang jalur optik 1 cm dan diaduk. Setelah 10 menit, densitas optik diukur pada spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm terhadap sampel kosong (kuvet dengan 0,5 ml urin dan 1,5 ml larutan natrium klorida 0,9%). Perhitungan konsentrasi protein dilakukan sesuai dengan jadwal kalibrasi. Untuk konstruksinya, pengenceran larutan standar albumin serum manusia dalam larutan natrium klorida 0,9% dengan konsentrasi: 0,025; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0.8; 0,9 g / l. Untuk masing-masing solusi yang disiapkan, pengukuran dilakukan dengan cara yang sama seperti dengan sampel urin. Grafik kalibrasi ditunjukkan pada Gbr.1.

Fig. 1. Kurva kalibrasi untuk penentuan protein dalam urin dengan metode sulfosalicylic.

Kit komersial yang diproduksi oleh Biocon Diagnostik (Jerman) - Fluitest USP - Protein, metode ultra-sensitif berbasis pada kompleks pyrogallol-molybdate merah, digunakan.

Reagen: pirogalol merah, 0,06 mmol / l, natrium molibdat, 0,04 mmol / l, buffer suksinat 50 mmol / l, pH 2,5, deterjen 2%; Calibrator (larutan kalibrasi albumin serum, 50 g / l, dalam larutan natrium klorida, 0,9% dan natrium azida, 0,095%) dari kit "Uni-Test - Total Protein" yang diproduksi oleh "Diakon DS" dengan urutan "A / Tentang Unimed ”. [3].

Peralatan: fotometer biokimia StatFax 1904 Plus ("Teknologi Kesadaran inc.", AS).

Kurva kalibrasi untuk metode yang dijelaskan dengan rasio sampel / reagen - 1 / 12,5 diperoleh dengan menggunakan larutan serum albumin yang disiapkan secara khusus: 0,05; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0.8; 0,9; 1,0, g / l dengan menipiskan kalibrator (50 g / l) dengan larutan natrium klorida 0,9%, (Gbr.2).

Gambar. 2. Kurva kalibrasi untuk metode pyrogallol red, pereaksi Fluitest USP, Biocon Diagnostik (Jerman) dengan rasio sampel / reagen 1 / 12,5.

80 μl diambil dari setiap larutan protein dan dicampur dengan 1,0 ml reagen; diukur sebagai sampel urin.

Fig. 3. Diagram perbandingan hasil pengukuran kadar protein dalam sampel urin dengan metode sulfosalicylic dan pyrogallol.

Kurva kalibrasi untuk reagen yang diproduksi oleh Unimed A / O dan Biocon Diagnostik, dengan rasio sampel / reagen 1/30, diperoleh dengan menggunakan larutan serum albumin yang disiapkan secara khusus: 0,05; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0.8; 0,9; 1.0, 1.1; 1.2; 1.3; 1.4; 1.5; 1.6; 1.7; 1,75; 1.8; 1.85; 1.9; 2,0 g / l dengan mengencerkan kalibrator (50 g / l) dengan larutan natrium klorida 0,9% (Gbr.4).

Fig. 4. Kurva kalibrasi untuk reagen A / O Unimed (grafik atas) dan kit USP Fluitest dari Biocon Diagnostik (grafik bawah) dengan rasio sampel / reagen 1/30.

50 μl diambil dari masing-masing larutan protein dan dicampur dengan 1,5 ml reagen dan diukur sebagai sampel urin.

Dalam penelitian ini, untuk mencapai sensitivitas maksimum metode pyrogallol, varian yang dimodifikasi sangat sensitif digunakan. Untuk ini, volume urin yang ditambahkan telah meningkat. Kursus pengukuran: 1 ml reagen utama ditambahkan ke semua tabung, kemudian 80 μl air suling (kosong) ditambahkan ke tabung pertama, 80 μl urin disentrifugasi ditambahkan ke tabung yang tersisa, diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit, dan kepadatan optik sampel diukur terhadap blanko Panjang gelombang 600 nm dan filter diferensial 650 nm

Untuk membandingkan metode untuk menentukan konsentrasi protein dalam urin, 60 sampel urin pasien diukur dengan metode sulphosalicylic dan pyrogallol.

Sensitivitas metode untuk mengukur protein dalam urin dinilai dengan memeriksa larutan berair urin yang mengandung kadar albumin serum rendah (dari 0 hingga 0,05 g / l). Untuk metode pyrogallol dan sulfosalicylic, kami juga menyelidiki nilai penyerapan spesifik karena warna sampel urin. Untuk ini, kepadatan optik sampel urin diukur, di mana, alih-alih asam sulfosalisilat atau reagen pirogalol, jumlah garam yang setara ditambahkan.

Untuk menilai efek dari matriks (urin) pada hasil metode sulfosalisilat, percobaan berikut dilakukan.

1) Dalam sampel urin yang tidak mengandung protein, menurut metode pirogalol dan sulfosalisilat (n = 43), serum albumin manusia ditambahkan pada konsentrasi akhir 0,4 g / l. Kemudian, menggunakan metode di atas, konsentrasi protein dalam sampel disiapkan ditentukan.

2) Sampel urin (n = 16), memiliki protein sesuai dengan metode pyrogallol, diencerkan dua kali dengan larutan natrium klorida 0,9%. Sampel yang diperoleh diperiksa ulang dengan metode sulfosalisilat, konsentrasi protein dihitung ulang untuk pengenceran.

Hasil penelitian dan diskusi

Sebuah studi sampel urin yang mengandung konsentrasi albumin spesifik menunjukkan bahwa konsentrasi albumin minimum yang dapat dideteksi (sensitivitas metode) adalah 0,033 g / l untuk metode sulfosalisilat, dan 0,012 g / l untuk metode pirogalol.

Hasil pengukuran dalam bentuk diagram perbandingan hasil pengukuran kadar protein dalam sampel urin dengan metode sulfosalisilat (sumbu ordinasi) dan pirogalol (sumbu absis) ditunjukkan pada Gambar. 3. Garis miring padat pada grafik sesuai dengan kesetaraan hasil pengukuran dengan dua metode. Jika kedua metode memberikan nilai yang sama, maka titik pada grafik harus dikelompokkan di dekat garis padat. Data ditunjukkan pada Gambar. 3, kita juga dapat mencatat bahwa metode sulfosalisilat secara konsisten menunjukkan konsentrasi protein yang lebih rendah dalam semua sampel urin dibandingkan dengan metode pyrogallol.

Seperti yang ditunjukkan dalam penelitian ini, antara hasil yang diperoleh dengan menggunakan metode sulfosalicylic dan pyrogallol, tidak ada hubungan statistik yang meyakinkan. Selain itu, dibandingkan dengan metode pirogalol, metode sulfosalisilat pada 95% sampel urin menunjukkan nilai konsentrasi protein yang lebih rendah. Pada saat yang sama, pada 86% kasus, pengukuran dengan metode sulfosalisilat memberikan hasil yang terlalu rendah sebanyak dua kali atau lebih dibandingkan dengan metode pyrogallol.

Pada saat yang sama, metode sulfosalicylic dalam beberapa kasus menunjukkan adanya protein dalam sampel karena warna gelap atau peningkatan kekeruhan urin yang diteliti. Ditetapkan bahwa dalam menentukan protein dengan metode sulfosalisilat (sampel / rasio reagen = 1/3) pada panjang gelombang 595 nm, kontribusi sampel urin karena warna atau kekeruhannya terhadap hasil dapat dari 0 hingga 0,247 g / l (nilai rata-rata - 0,031 g / l). Dengan demikian, harus diakui bahwa ketika menggunakan metode sulfosalisilat, penggunaan sampel kontrol (sampel urin + salin) untuk setiap sampel urin adalah wajib. Ketika menentukan protein dengan metode pyrogallol, warna atau tingkat kekeruhan sampel urin tidak mempengaruhi hasilnya.

Eksperimen pada penilaian efek matriks (urin) menunjukkan bahwa di hampir semua sampel urin yang disiapkan mengandung 0,4 g / l albumin, konsentrasinya, yang ditentukan oleh metode sulfo-salisilat, berada di bawah 0,4 g / l rata-rata sebesar 20% (nilai batas) konsentrasi protein 0,29-0,34 g / l). Pada saat yang sama, ketika mengukur konsentrasi protein dalam sampel ini dengan metode pyrogallol, hasil untuk semua sampel berada dalam kisaran 0,40-0,46 g / l. Juga, ketika menilai efek dari matriks (urin) pada hasil pengukuran konsentrasi protein dengan metode sulfosalisilat, ditemukan bahwa dalam 5 dari 16 sampel urin yang diencerkan dua kali lipat, konsentrasi protein 15-33% lebih tinggi daripada sampel non-encer yang sesuai. Untuk penjelasan akhir dari efek matriks pada hasil metode sulfosalisilat, penelitian pada sejumlah besar sampel urin diperlukan.

Dengan demikian, data yang diperoleh menunjukkan keuntungan dari metode pyrogallol dibandingkan metode sulfosalicylic karena sensitivitasnya yang lebih tinggi dan kerentanan terhadap faktor-faktor yang mengganggu, tidak perlu sampel urin kosong, kemungkinan menggunakan satu standar untuk membangun kurva kalibrasi, dan sejumlah kecil urin untuk analisis. Kehadiran karakteristik tersebut memungkinkan kami untuk merekomendasikan metode pyrogallol untuk digunakan secara luas dalam praktik laboratorium.

Dari data yang diperoleh, suatu kesimpulan berikut: hasil pengukuran konsentrasi protein dalam urin dengan metode sulfosalisilat tidak dapat dibandingkan dengan hasil yang diperoleh dengan metode pirogalol. Fakta ini adalah jawaban untuk pertanyaan - mengapa laboratorium di negara maju tidak menggunakan metode sulfosalisilat. Penerapan metode ini di negara-negara terbelakang, tampaknya, dijelaskan oleh fakta bahwa ada faktor harga yang menang atas keakuratan dan signifikansi diagnostik dari hasil yang diperoleh, dan, mengingat angka-angka yang disajikan dalam gambar. 3 hasil, dapat dikatakan, dan lebih dari akal sehat. Siapa yang butuh analisis seperti itu, ketika pada konsentrasi protein dalam urin 0,3 g / l, hasil pengukuran dapat dari 0,05 hingga 0,25 g / l? Adapun faktor harga, maka, seperti yang Anda tahu, orang kikir membayar dua kali. Hasil analisis yang salah mengarah pada diagnosis yang salah dan perawatan pasien yang tidak efektif. Bahaya utama menggunakan metode sulfosalisilat adalah bahwa kita mendapatkan nilai yang terlalu rendah secara signifikan dan tidak jarang melewatkan proteinuria. Oleh karena itu, metode ini tidak dapat diterapkan bahkan untuk penyaringan.

Jadi apa yang kita ukur dengan metode sulfosalisilat? Metode ini termasuk kelas turbidimetri, berdasarkan pengukuran perubahan transmisi cahaya (DD) dari campuran reaksi karena hamburan cahaya (kekeruhan). Dalam hal deteksi protein dalam urin, kekeruhan terbentuk karena proses berikut ini: molekul protein urin dalam media asam didenaturasi, bergerak dari bentuk globular kompak ke bentuk “filamen” longgar. Pada saat yang sama, kemampuan pembentukan konglomerat meningkat tajam (reaksi presipitasi) dalam protein. Molekul protein individu lebih kecil dari panjang gelombang cahaya tampak dan oleh karena itu sangat lemah menyebarkannya. Efisiensi hamburan meningkat secara dramatis ketika ukuran konglomerat molekul protein yang dihasilkan mendekati nilai 0,6 μm (panjang gelombang cahaya yang menyelidik). Semakin besar konsentrasi protein dalam urin, semakin besar jumlah konglomerat tersebut (pusat hamburan) terbentuk. Namun, hubungan antara kepadatan optik DD diukur pada fotometer dan konsentrasi protein dalam urin sangat kompleks. Pada tahap awal reaksi, sejumlah partikel protein kecil terbentuk, kemudian mereka mulai bersatu menjadi partikel yang lebih besar, sementara konsentrasi pusat hamburan menurun, dan efisiensi (penampang) hamburan setiap pusat meningkat. Pada waktu tertentu, kami memiliki dalam campuran reaksi sejumlah pusat hamburan dengan ukuran yang berbeda. Pada konsentrasi tinggi protein dalam urin dapat membentuk partikel protein besar yang mengendap, yang mengarah pada penurunan kepadatan optik campuran reaksi.

Proses denaturasi protein dan reaksi presipitasi bergantung pada komposisi media di mana mereka terjadi (pH, konsentrasi berbagai garam). Untuk mengkalibrasi metode ini, kami menggunakan larutan albumin manusia berair dengan penambahan 0,9% natrium klorida. Ketika kita mengukur konsentrasi protein dalam urin, kita tidak tahu dan tidak memperhitungkan pH urin atau komposisi garamnya. Kami juga tidak memperhitungkan fakta bahwa protein berbeda bereaksi secara berbeda dalam larutan asam sulfosalisilat. Ini menjelaskan besarnya hasil pengukuran yang disajikan pada Gambar. 3. Semakin dekat komposisi urin dengan komposisi kalibrator, semakin akurat hasil pengukuran. Namun, sangat sedikit sampel urin tersebut. Dalam kebanyakan kasus, komposisi urin sedemikian rupa sehingga hasil pengukuran diremehkan dan seringkali cukup signifikan.

Yang terakhir dikonfirmasi oleh percobaan yang dijelaskan di atas, di mana konsentrasi protein diukur dengan metode sulfosalisilat dalam sampel urin yang tidak diencerkan dan berlipat ganda. Perbandingan dari data yang diperoleh menunjukkan bahwa pengenceran urin (dengan mempertimbangkan tingkat pengenceran) mengarah pada peningkatan hasil pengukuran konsentrasi protein sebesar 15-33%. Fakta ini menegaskan pengaruh signifikan komposisi urin terhadap hasil penentuan konsentrasi protein (efek matriks).

Mengapa metode pyrogallol memungkinkan untuk mendapatkan hasil yang lebih akurat untuk mengukur konsentrasi protein dalam urin? Pertama, karena banyaknya pengenceran sampel urin dalam campuran reaksi. Jika dalam metode sulfosalisilat rasio sampel / reagen urin 1/3, maka dalam metode pirogalol dapat berada dalam kisaran 1 / 12,5 hingga 1/60, tergantung pada varian teknik, yang secara signifikan mengurangi pengaruh komposisi urin pada hasil pengukuran. Kedua, reaksi berlangsung dalam buffer suksinat, yaitu pada pH stabil. Dan akhirnya, prinsip metode ini, jika dapat dikatakan demikian, lebih transparan. Sodium molibdat dan pewarna merah pirogalol membentuk kompleks dengan molekul protein. Ini mengarah pada fakta bahwa molekul pewarna, dalam keadaan bebas, tidak menyerap cahaya pada panjang gelombang 600 nm, dalam kombinasi dengan protein, menyerap cahaya. Jadi, kita tampaknya menandai setiap molekul protein dengan zat pewarna dan sebagai hasilnya kita menemukan bahwa perubahan dalam kepadatan optik campuran reaksi pada panjang gelombang 600 nm secara unik terkait dengan konsentrasi protein dalam urin.

Sebagai kesimpulan, perbedaan paling signifikan antara metode sulfosalisilat untuk menentukan protein dalam urin dan metode menggunakan pewarna merah pyrogallol disajikan pada Tabel No. 1.

Tab. 1. Karakteristik komparatif dari dua metode untuk menentukan protein dalam urin (metode sulfosalisilat dan pirogalol)

Penentuan protein urin dengan pirogalol merah

Prinsip metode ini didasarkan pada pengukuran fotometrik dari kerapatan optis suatu larutan kompleks berwarna yang dibentuk oleh interaksi molekul protein dengan molekul kompleks pewarna merah pyrogallol dan natrium molybdate (kompleks Pyrogallol Red-Molybdate) dalam media asam. Intensitas warna larutan sebanding dengan kadar protein dalam bahan yang diteliti. Kehadiran deterjen dalam reagen memberikan definisi setara protein dari sifat dan struktur yang berbeda.

Reagen. 1) 1,5 mmol / l larutan pyrogallol red (PGA): 60 mg PGA dilarutkan dalam 100 ml metanol. Simpan pada suhu 0–5 ° С; 2) 50 mmol / l larutan buffer suksinat pH 2,5: 5,9 g asam suksinat (HOOC - CH₂–СН₂–COOH); 0,14 g natrium oksalat (Na₂C₂O₄) dan 0,5 g natrium benzoat (C₆H₅COONa) dilarutkan dalam 900 ml air suling; 3) 10 mmol / l larutan natrium molibdat kristalohidrat (Na₂Moo₄ × 2H₂O): 240 mg natrium molibdat dilarutkan dalam 100 ml air suling; 4) Reagen yang bekerja: hingga 900 ml larutan buffer suksinat tambahkan 40 ml larutan PHC dan 4 ml larutan natrium molibdat. PH larutan diatur menjadi 2,5 dengan larutan 0,1 mol / l asam hidroklorat (HCl) dan volumenya disesuaikan menjadi 1 l. Pereaksi dalam bentuk ini siap digunakan dan stabil bila disimpan di tempat gelap dan pada suhu 2–25 ° C selama 6 bulan; 5) 0,5 g / l larutan albumin standar.

Jalannya tekad. 0,05 ml urin yang diteliti dimasukkan ke dalam tabung reaksi pertama, 0,05 ml larutan standar albumin ditambahkan ke tabung reaksi kedua dan 0,05 ml air suling ke tabung reaksi ketiga (sampel kontrol), kemudian 3 ml reagen kerja ditambahkan ke tabung reaksi ini. Isi tabung dicampur dan setelah 10 menit, sampel dan standar difoto terhadap sampel kontrol pada panjang gelombang 596 nm dalam kuvet dengan panjang jalur optik 10 mm.

Perhitungan konsentrasi protein dalam sampel urin yang dianalisis dilakukan sesuai dengan rumus:

di mana C adalah konsentrasi protein dalam sampel urin yang dianalisis, g / l; A_pr dan a_st- kepunahan sampel urin yang diteliti dan larutan albumin standar, g / l; 0,5 - konsentrasi larutan albumin standar, g / l.

• warna larutan (kompleks warna) stabil selama satu jam;
• hubungan proporsional langsung antara konsentrasi protein dalam sampel dan penyerapan larutan tergantung pada jenis fotometer;
• ketika kandungan protein dalam urin di atas 3 g / l, sampel diencerkan dengan larutan natrium klorida isotonik (9 g / l) dan penentuan diulang. Tingkat pengenceran diperhitungkan saat menentukan konsentrasi protein.

Kami merawat hati

Pengobatan, gejala, obat-obatan

Penentuan protein merah dalam pirogalol dalam urin

02.26.2009

Kurilyak O.A., Ph.D.

Biasanya, protein diekskresikan dalam urin dalam jumlah yang relatif kecil, biasanya tidak lebih dari 100-150 mg / hari.

Diuresis harian pada orang sehat adalah 1000-1500 ml / hari; dengan demikian, konsentrasi protein dalam kondisi fisiologis adalah 8-10 mg / dL (0,08-0,1 g / l).

Total protein urin diwakili oleh tiga fraksi utama - albumin, mucoprotein dan globulin.

Albumin urin adalah bagian dari albumin serum yang telah disaring di glomeruli dan belum diserap kembali dalam tubulus ginjal; dalam ekskresi normal albumin dalam urin kurang dari 30 mg / hari. Sumber protein utama lain dalam urin adalah tubulus ginjal, terutama bagian distal tubulus. Tubulus ini mengeluarkan dua pertiga dari jumlah total protein urin; dari jumlah ini, sekitar 50% diwakili oleh glikoprotein Tamm-Horsfall, yang disekresikan oleh epitel tubulus distal dan memainkan peran penting dalam pembentukan batu kemih. Protein lain hadir dalam urin dalam jumlah kecil dan berasal dari protein plasma berat molekul rendah yang disaring melalui filter ginjal, yang tidak diserap kembali dalam tubulus ginjal, mikroglobulin dari epitel tubulus ginjal (RTE), serta pelepasan prostat dan vagina.

Proteinuria, yaitu, peningkatan kandungan protein dalam urin adalah salah satu gejala yang paling signifikan, yang mencerminkan kerusakan ginjal. Namun, sejumlah kondisi lain juga dapat disertai dengan proteinuria. Oleh karena itu, ada dua kelompok utama proteinuria: proteinuria ginjal (benar) dan ekstrarenal (salah).

Pada proteinuria ginjal, protein memasuki urin langsung dari darah karena peningkatan permeabilitas filter glomerulus. Proteinuria ginjal sering ditemukan pada glomerulonefritis, nefrosis, pielonefritis, nefrosklerosis, amiloidosis ginjal, berbagai bentuk nefropati, misalnya nefropati pada wanita hamil, demam, hipertensi, dll. Proteinuria juga dapat ditemukan pada orang sehat setelah aktivitas fisik yang parah, hipotermia, dan stres psikologis. Pada bayi baru lahir, proteinuria fisiologis diamati pada minggu-minggu pertama kehidupan, dan ketika asthenia terjadi pada anak-anak dan remaja, proteinuria ortostatik (dalam posisi tubuh tegak) dimungkinkan dalam kombinasi dengan pertumbuhan yang cepat antara usia 7 dan 18 tahun.

Dalam hal proteinuria palsu (ekstrarenal), sumber protein dalam urin adalah campuran leukosit, eritrosit, sel epitel saluran kemih urothelia. Pembusukan elemen-elemen ini, terutama diucapkan dengan urin alkali, menyebabkan masuknya protein ke dalam urin, yang telah melewati filter ginjal. Tingkat proteinuria palsu yang sangat tinggi memberikan darah dalam urin, dengan hematuria yang banyak, dapat mencapai 30 g / l dan lebih banyak lagi. Penyakit yang dapat disertai oleh proteinuria ekstrarenal - urolitiasis, tuberkulosis ginjal, tumor ginjal atau saluran kemih, sistitis, pielitis, prostatitis, uretritis, vulvovaginitis.

Klasifikasi klinis meliputi proteinuria ringan (kurang dari 0,5 g / hari.), Sedang (dari 0,5 hingga 4 g / hari.), Atau parah (lebih dari 4 g / hari.).

Sebagian besar pasien dengan penyakit ginjal, seperti glomerulonefritis akut atau pielonefritis, mengungkapkan proteinuria sedang, tetapi pasien dengan sindrom nefrotik biasanya mengeluarkan lebih dari 4 g protein dalam urin setiap hari.

Untuk penentuan kuantitatif protein, berbagai metode digunakan, khususnya, metode Brandberg-Roberts-Stolnikov yang terpadu, metode biuret, metode asam sulfosalisilat, metode yang menggunakan pewarna biru Coomassie, pewarna pirogalol merah, dll.

Penggunaan berbagai metode untuk menentukan protein dalam urin telah menyebabkan kebingungan serius dalam interpretasi batas-batas norma kandungan protein dalam urin. Karena 2 metode paling umum digunakan di laboratorium - dengan asam sulfosalisilat dan pewarna merah pyrogallol, kami mempertimbangkan masalah ketepatan batas-batas norma untuknya. Dari sudut pandang metode sulfosalisilat dalam urin normal, kandungan protein tidak boleh melebihi 0,03 g / l, dan dari sudut pandang pyrogallol, 0,1 g / l! Perbedaannya ada tiga.

Nilai rendah dari konsentrasi normal protein dalam urin saat menggunakan sulfosalicylic karena beberapa hal berikut:

• kurva kalibrasi didasarkan pada larutan albumin. Urin dalam komposisinya sangat berbeda dengan air: pH, garam, senyawa dengan berat molekul rendah (kreatinin, urea, dll.). Akibatnya, menurut Altshuler, Rakov dan Tkachev, kesalahan dalam menentukan protein urin bisa 3 kali atau lebih! Yaitu hasil yang benar dapat diperoleh hanya dalam kasus-kasus di mana urin memiliki berat jenis yang sangat rendah dan komposisi serta pH mendekati air;
• semakin tinggi sensitivitas metode sulfosalisilat terhadap albumin dibandingkan dengan protein lain (pada waktu itu, seperti yang disebutkan di atas, albumin dalam sampel urin normal tidak lebih dari 30% dari total protein urin);
• jika pH urin dialihkan ke sisi basa, asam sulfosalisilat dinetralkan, yang juga menyebabkan penurunan hasil penentuan protein;
• laju endapan endapan tunduk pada variasi yang signifikan - pada konsentrasi protein rendah, pengendapan diperlambat, dan penghentian awal reaksi menyebabkan perkiraan hasil yang terlalu rendah;
• laju reaksi presipitasi pada dasarnya tergantung pada pencampuran campuran reaksi. Pada konsentrasi protein yang tinggi, goncangan tabung yang kuat dapat menyebabkan pembentukan serpihan besar dan curah hujannya yang cepat.

Semua fitur yang tercantum di atas dari metode ini mengarah pada perkiraan konsentrasi protein yang ditentukan dalam urin. Tingkat kekurangan pelaporan sangat tergantung pada komposisi sampel urin tertentu. Karena metode asam sulfosalisilat memberikan nilai konsentrasi protein yang terlalu rendah, batas normal untuk metode ini adalah 0,03 g / l, juga, sekitar tiga kali terlalu rendah dibandingkan dengan data yang diberikan dalam buku referensi asing tentang diagnostik laboratorium klinis.

Sebagian besar laboratorium di negara-negara Barat telah meninggalkan penggunaan metode sulfosalicylic untuk menentukan konsentrasi protein dalam urin dan secara aktif menggunakan metode pyrogallol untuk tujuan ini. Metode pyrogallol untuk menentukan konsentrasi protein dalam urin dan cairan biologis lainnya didasarkan pada prinsip fotometrik untuk mengukur kepadatan optik kompleks berwarna yang dibentuk oleh interaksi molekul protein dengan molekul kompleks pewarna merah pyrogallol dan molekul molibdat natrium (kompleks Pyrogallol Merah - Molibdat).

Mengapa metode pyrogallol memungkinkan untuk mendapatkan hasil yang lebih akurat untuk mengukur konsentrasi protein dalam urin? Pertama, karena banyaknya pengenceran sampel urin dalam campuran reaksi. Jika dalam metode sulfosalisilat rasio sampel / reagen urin 1/3, maka dalam metode pirogalol dapat berada dalam kisaran 1 / 12,5 hingga 1/60, tergantung pada varian teknik, yang secara signifikan mengurangi pengaruh komposisi urin pada hasil pengukuran. Kedua, reaksi berlangsung dalam buffer suksinat, yaitu pada pH stabil. Dan, akhirnya, prinsip metode ini dapat dikatakan lebih "transparan". Sodium molibdat dan pewarna merah pirogalol membentuk kompleks dengan molekul protein. Hal ini mengarah pada fakta bahwa molekul pewarna dalam keadaan bebas yang tidak menyerap cahaya pada panjang gelombang 600 nm dalam kombinasi dengan protein menyerap cahaya. Jadi, kita tampaknya menandai setiap molekul protein dengan zat pewarna dan, sebagai akibatnya, kita melihat bahwa perubahan kepadatan optik campuran reaksi pada panjang gelombang 600 nm jelas berkorelasi dengan konsentrasi protein dalam urin. Selain itu, karena afinitas pirogalol merah terhadap fraksi protein yang berbeda hampir sama, metode ini memungkinkan untuk menentukan total protein urin. Oleh karena itu, batas nilai normal konsentrasi protein dalam urin adalah 0,1 g / l (ini ditunjukkan dalam semua pedoman Barat modern untuk diagnostik klinis dan laboratorium, termasuk Manual Klinis untuk Tes Laboratorium, diedit oleh N. Tits). Karakteristik komparatif metode pirogalol dan sulfosalisilat untuk menentukan protein urin disajikan pada Tabel 1.

Sebagai kesimpulan, saya ingin sekali lagi fokus pada fakta bahwa ketika laboratorium beralih dari metode sulfosalicylic untuk menentukan protein urin ke metode pyrogallol, batas nilai normal meningkat secara signifikan (dari 0,03 g / l menjadi 0,1 g / l!). Staf laboratorium ini tentu harus memberi tahu dokter, karena Dalam situasi ini, diagnosis proteinuria hanya dapat dilakukan jika kadar protein dalam urin melebihi 0,1 g / l.

3. Penentuan protein.

Prinsip metode berdasarkan pada koagulasi protein dalam urin dengan adanya asam nitrat (atau 20% larutan sulfosalisilat).

Kemajuan kerja: ke 5 tetes urin, tambahkan 1-2 tetes asam nitrat (atau sulfosalisilat). Dengan adanya protein dalam urin muncul kekeruhan.

Meja Deteksi komponen patologis urin.

Catatan: dengan adanya glukosa dan protein dalam urin yang diperiksa, konten kuantitatifnya ditentukan.

Penentuan kuantitatif protein dalam urin dengan metode kolorimetri dengan pirogalol merah.

Prinsip metode: Ketika protein berinteraksi dengan pyrogallol red dan sodium molybdate, kompleks berwarna terbentuk, intensitas warna, yang sebanding dengan konsentrasi protein dalam sampel.

Reagen: Reagen kerja - larutan merah pyrogallol dalam buffer suksinat, larutan protein kalibrasi dengan konsentrasi 0,50 g / l

Campuran sampel, tahan selama 10 menit. pada suhu kamar (18-25 ° C). Mengukur kepadatan optik yang dialami (D_op) dan sampel kalibrasi (D_untuk) terhadap sampel kontrol pada λ = 598 (578-610) nm. Warna stabil selama 1 jam.

Perhitungan: konsentrasi protein dalam urin (C) g / l dihitung dengan rumus:

Nilai normal: hingga 0,094 g / l, (0,141 g / hari)

Penentuan kuantitatif glukosa dalam urin dengan metode glukosa oksidase.

Prinsip metode: Ketika D-glukosa dioksidasi oleh oksigen atmosfer di bawah aksi glukosa oksidase, sejumlah hidrogen peroksida yang sama terbentuk. Di bawah aksi peroksidase, hidrogen peroksida mengoksidasi substrat kromogenik (campuran fenol dan 4 aminoantipirin - 4ААP) dengan pembentukan produk berwarna. Intensitas warna sebanding dengan kadar glukosa.

2 N₂Oh₂ + fenol + 4ААП senyawa berwarna + 4Н₂Oh

Kemajuan kerja: 1 ml larutan kerja dan 0,5 ml buffer fosfat dimasukkan ke dalam dua tabung. 0,02 ml urin ditambahkan ke tabung pertama, dan 0,02 ml kalibrator ditambahkan ke tabung kedua (kalibrasi, larutan standar glukosa, 10 mmol / l). Sampel dicampur, diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37 ° C dalam termostat, dan kepadatan optik diukur dengan eksperimental (D_op) dan kalibrasi (D_untuk) sampel terhadap reagen yang bekerja pada panjang gelombang 500-546 nm.

Kandungan glukosa dalam urin harian ditentukan oleh mmol / hari dengan mengalikan hasil yang diperoleh dengan volume urin yang dikumpulkan per hari.

Catatan Ketika kadar gula dalam urin lebih dari 1% harus diencerkan.

Saat ini, laboratorium biokimia menggunakan metode ekspres terpadu untuk menganalisis urin untuk glukosa menggunakan tes glukosa reaktif, tes glukosa atau menggunakan strip tes gabungan untuk pH, protein, glukosa, badan keton dan darah. Strip uji, direndam dalam wadah dengan urin selama 1 detik. dan membandingkan warna pada skala.

Dokter Hepatitis

pengobatan hati

Protein normal dalam metode pirogalol urin

Orang yang sehat menghasilkan 1,0-1,5 liter urin per hari. Kandungan 8-10 mg / dl protein di dalamnya adalah fenomena fisiologis. Asupan protein harian dalam urin 100-150 mg seharusnya tidak menimbulkan kecurigaan. Globulin, mucoprotein, dan albumin adalah apa yang membentuk protein total dalam urin. Aliran keluar albumin yang besar mengindikasikan pelanggaran proses penyaringan dalam ginjal dan disebut proteinuria atau albuminuria.

Setiap zat dalam urin diberikan tingkat "sehat", dan jika indeks protein berfluktuasi, ini mungkin menunjukkan patologi ginjal.

Urinalisis melibatkan penggunaan bagian pertama (pagi), atau mengambil sampel harian. Yang terakhir lebih disukai untuk menilai tingkat proteinuria, karena kandungan protein telah menyatakan fluktuasi harian. Urin di siang hari dikumpulkan dalam satu wadah, ukur volume total. Untuk laboratorium yang melakukan analisis protein urin, sampel standar (dari 50 hingga 100 ml) dari wadah ini cukup, jumlah yang tersisa tidak diperlukan. Untuk informasi lebih lanjut, tes tambahan dilakukan pada Zimnitsky, yang menunjukkan apakah indikator urin per hari normal.

Kembali ke daftar isi

Protein dalam urin normal pada orang dewasa tidak boleh melebihi 0,033 g / l. Pada saat yang sama, laju harian tidak lebih tinggi dari 0,05 g / l. Untuk wanita hamil, tingkat protein dalam urin harian lebih - 0,3 g / l., Dan di pagi hari urin sama - 0,033 g / l. Standar protein berbeda dalam analisis umum urin dan pada anak-anak: 0,036 g / l untuk porsi pagi dan 0,06 g / l per hari. Paling sering, laboratorium melakukan analisis menggunakan dua metode, yang menunjukkan berapa banyak fraksi protein yang terkandung dalam urin. Nilai normal di atas valid untuk analisis yang dilakukan dengan asam sulfosalisilat. Jika pewarna merah pyrogallol digunakan, nilainya akan tiga kali berbeda.

Kembali ke daftar isi

Penyebab protein dalam urin bisa menjadi proses patologis di ginjal:

• filtrasi di glomeruli ginjal berjalan dengan cara yang salah;
• penyerapan tubulus protein terganggu;
• Beberapa penyakit memiliki beban yang kuat pada ginjal - ketika protein dalam darah meningkat, ginjal benar-benar “tidak punya waktu” untuk menyaringnya.

Alasan yang tersisa dianggap bukan ginjal. Inilah bagaimana albuminuria fungsional berkembang. Protein dalam analisis urin muncul dalam reaksi alergi, epilepsi, gagal jantung, leukemia, keracunan, myeloma, kemoterapi, penyakit sistemik. Paling sering, indikator dalam analisis pasien ini akan menjadi lonceng pertama penyakit hipertensi.

Peningkatan protein urin mungkin karena faktor-faktor yang bersifat non-patologis, sehingga analisis tambahan akan diperlukan.

Metode kuantitatif untuk menentukan protein dalam urin memberikan kesalahan, oleh karena itu, disarankan untuk melakukan beberapa analisis, dan kemudian menggunakan rumus untuk menghitung nilai yang benar. Kandungan protein urin diukur dalam g / l atau mg / l. Indikator protein ini memungkinkan untuk menentukan tingkat proteinuria, menyarankan alasan, mengevaluasi prognosis dan menentukan strategi.

Kembali ke daftar isi

Untuk berfungsinya tubuh secara penuh, dibutuhkan pertukaran yang konstan antara darah dan jaringan. Itu hanya mungkin terjadi jika ada tekanan osmotik tertentu dalam pembuluh darah. Protein plasma darah hanya mempertahankan tingkat tekanan seperti itu, ketika zat dengan molekul rendah mudah berpindah dari medium dengan konsentrasi tinggi ke medium dengan konsentrasi lebih rendah. Hilangnya molekul protein menyebabkan pelepasan darah dari tempat tidur ke jaringan, yang penuh dengan edema yang kuat. Ini adalah manifestasi dari proteinuria sedang dan berat.

Tahap awal albuminuria tidak menunjukkan gejala. Pasien hanya memperhatikan manifestasi penyakit yang mendasarinya, yang merupakan penyebab protein dalam urin.

Trace proteinuria disebut peningkatan kadar protein dalam urin karena penggunaan produk-produk tertentu.

Urin untuk analisis dikumpulkan dalam wadah skim yang bersih. Sebelum mengumpulkan toilet ditampilkan perineum, Anda perlu mencuci dengan sabun dan air. Wanita disarankan untuk menutup vagina dengan sepotong kapas atau tampon sehingga keputihan tidak mempengaruhi hasilnya. Pada malam hari lebih baik untuk tidak minum alkohol, air mineral, kopi, pedas, asin, dan makanan yang memberi warna urine (blueberry, bit). Pengerahan tenaga fisik yang kuat, berjalan jauh, stres, demam dan berkeringat, konsumsi makanan protein atau obat yang berlebihan sebelum memberikan urin memicu munculnya protein dalam analisis urin orang yang benar-benar sehat. Fenomena yang diizinkan ini disebut trace proteinuria.

Kembali ke daftar isi

Penyakit ginjal yang menyebabkan hilangnya protein:

• Amiloidosis. Sel-sel normal di ginjal digantikan oleh amiloid (protein-sakarida kompleks), yang mencegah tubuh bekerja secara normal. Pada tahap proteinurik, amiloid disimpan dalam jaringan ginjal, menghancurkan nefron dan, sebagai hasilnya, filter ginjal. Jadi protein masuk dari darah ke urin. Tahap ini bisa bertahan lebih dari 10 tahun.
• Nefropati diabetik. Karena metabolisme karbohidrat dan lipid yang tidak tepat, pembuluh darah, glomeruli dan tubulus di ginjal hancur. Protein dalam urin adalah tanda pertama dari komplikasi diabetes yang diperkirakan.
• Penyakit genesis inflamasi - nefritis. Paling sering, lesi mempengaruhi pembuluh darah, sistem glomeruli dan pielokaliceal, mengganggu jalannya normal sistem penyaringan.
• Glomerulonefritis pada kebanyakan kasus bersifat autoimun. Pasien mengeluhkan penurunan jumlah urin, nyeri punggung bawah dan peningkatan tekanan. Untuk pengobatan glomerulonefritis merekomendasikan diet, rejimen dan terapi obat.
• Pielonefritis. Pada periode akut terjadi gejala infeksi bakteri: menggigil, mual, sakit kepala. Ini adalah penyakit menular.
• Penyakit ginjal polikistik.

Dalam tubuh yang sehat, molekul protein (dan ukurannya agak besar) tidak dapat melewati sistem penyaringan ginjal. Karena itu, protein dalam urin seharusnya tidak. Indikator ini sama untuk pria dan wanita. Jika analisis menunjukkan proteinuria, penting untuk berkonsultasi dengan dokter karena alasan. Spesialis akan memperkirakan seberapa banyak level protein meningkat, apakah ada patologi yang bersamaan, bagaimana mengembalikan fungsi normal tubuh. Menurut statistik, wanita memiliki risiko lebih tinggi terkena penyakit urogenital daripada pria.

Prinsip metode berdasarkan pada koagulasi protein dalam urin dengan adanya asam nitrat (atau 20% larutan sulfosalisilat).

Kemajuan kerja: ke 5 tetes urin, tambahkan 1-2 tetes asam nitrat (atau sulfosalisilat). Dengan adanya protein dalam urin muncul kekeruhan.

Meja Deteksi komponen patologis urin.

Catatan: dengan adanya glukosa dan protein dalam urin yang diperiksa, konten kuantitatifnya ditentukan.

Prinsip metode: Ketika protein berinteraksi dengan pyrogallol red dan sodium molybdate, kompleks berwarna terbentuk, intensitas warna, yang sebanding dengan konsentrasi protein dalam sampel.

Reagen: Reagen kerja - larutan merah pyrogallol dalam buffer suksinat, larutan protein kalibrasi dengan konsentrasi 0,50 g / l

Campuran sampel, tahan selama 10 menit. pada suhu kamar (18-25 ° C). Ukur densitas optik eksperimental (Dop) dan sampel kalibrasi (Dk) terhadap sampel kontrol pada λ = 598 (578-610) nm. Warna stabil selama 1 jam.

Perhitungan: konsentrasi protein dalam urin (C) g / l dihitung dengan rumus:

dimana: Dop = Dk = C = g / l.

Nilai normal: hingga 0,094 g / l, (0,141 g / hari)

Prinsip metode: Ketika D-glukosa dioksidasi oleh oksigen atmosfer di bawah aksi glukosa oksidase, sejumlah hidrogen peroksida yang sama terbentuk. Di bawah aksi peroksidase, hidrogen peroksida mengoksidasi substrat kromogenik (campuran fenol dan 4 aminoantipirin - 4ААP) dengan pembentukan produk berwarna. Intensitas warna sebanding dengan kadar glukosa.

Glukosa + O2 + H2O glukololakton + H2O2

2H2O2 + fenol + 4AAP senyawa berwarna + 4H2O

Kemajuan kerja: 1 ml larutan kerja dan 0,5 ml buffer fosfat dimasukkan ke dalam dua tabung. 0,02 ml urin ditambahkan ke tabung pertama, dan 0,02 ml kalibrator ditambahkan ke tabung kedua (kalibrasi, larutan standar glukosa, 10 mmol / l). Sampel dicampur, diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37 ° C dalam termostat, dan kepadatan optik sampel eksperimental (Dop) dan kalibrasi (Dk) terhadap reagen kerja diukur pada panjang gelombang 500-546 nm.

Perhitungan: C = Dop / Dk  10 mmol / l Dop = Dk =

Kandungan glukosa dalam urin harian ditentukan oleh mmol / hari dengan mengalikan hasil yang diperoleh dengan volume urin yang dikumpulkan per hari.

Catatan Ketika kadar gula dalam urin lebih dari 1% harus diencerkan.

Saat ini, laboratorium biokimia menggunakan metode ekspres terpadu untuk menganalisis urin untuk glukosa menggunakan tes glukosa reaktif, tes glukosa atau menggunakan strip tes gabungan untuk pH, protein, glukosa, badan keton dan darah. Strip uji, direndam dalam wadah dengan urin selama 1 detik. dan membandingkan warna pada skala.

Penentuan protein menggunakan indikator merah pyrogallol

Prinsip metode ini didasarkan pada pengukuran fotometrik dari kerapatan optis suatu larutan kompleks berwarna yang dibentuk oleh interaksi molekul protein dengan molekul kompleks pewarna merah pyrogallol dan natrium molybdate (kompleks Pyrogallol Red-Molybdate) dalam media asam. Intensitas warna larutan sebanding dengan kadar protein dalam bahan yang diteliti. Kehadiran deterjen dalam reagen memberikan definisi setara protein dari sifat dan struktur yang berbeda.

Reagen. 1) 1,5 mmol / l larutan pyrogallol red (PGA): 60 mg PGA dilarutkan dalam 100 ml metanol. Simpan pada suhu 0–5 ° С; 2) 50 mmol / l larutan buffer suksinat pH 2,5: 5,9 g asam suksinat (HOOC - CH2 - CH2 - COOH); 0,14 g natrium oksalat (Na2C2O4) dan 0,5 g natrium benzoat (C6H5COONa) dilarutkan dalam 900 ml air suling; 3) 10 mmol / l larutan kristal hidrat natrium molibdat (Na2MoO4 × 2H2O): 240 mg natrium molibdat dilarutkan dalam 100 ml air suling; 4) Reagen yang bekerja: hingga 900 ml larutan buffer suksinat tambahkan 40 ml larutan PHC dan 4 ml larutan natrium molibdat. PH larutan diatur menjadi 2,5 dengan larutan 0,1 mol / l asam hidroklorat (HCl) dan volumenya disesuaikan menjadi 1 l. Pereaksi dalam bentuk ini siap digunakan dan stabil bila disimpan di tempat gelap dan pada suhu 2–25 ° C selama 6 bulan; 5) 0,5 g / l larutan albumin standar.

Jalannya tekad. 0,05 ml urin yang diteliti dimasukkan ke dalam tabung reaksi pertama, 0,05 ml larutan standar albumin ditambahkan ke tabung reaksi kedua dan 0,05 ml air suling ke tabung reaksi ketiga (sampel kontrol), kemudian 3 ml reagen kerja ditambahkan ke tabung reaksi ini. Isi tabung dicampur dan setelah 10 menit, sampel dan standar difoto terhadap sampel kontrol pada panjang gelombang 596 nm dalam kuvet dengan panjang jalur optik 10 mm.

Perhitungan konsentrasi protein dalam sampel urin yang dianalisis dilakukan sesuai dengan rumus:

C = 0,5 × Apr / Ast,

di mana C adalah konsentrasi protein dalam sampel urin yang dianalisis, g / l; Apr dan Ast - kepunahan sampel urin yang diselidiki dan larutan albumin standar, g / l; 0,5 - konsentrasi larutan albumin standar, g / l.

• warna larutan (kompleks warna) stabil selama satu jam;
• hubungan proporsional langsung antara konsentrasi protein dalam sampel dan penyerapan larutan tergantung pada jenis fotometer;
• ketika kandungan protein dalam urin di atas 3 g / l, sampel diencerkan dengan larutan natrium klorida isotonik (9 g / l) dan penentuan diulang. Tingkat pengenceran diperhitungkan saat menentukan konsentrasi protein.

• Penentuan protein urin
• Uji Coba Asam Sulfosalisilat terpadu
• Metode Unberg Brandberg - Roberts - Stolnikov
• Menentukan jumlah protein dalam urin melalui reaksi dengan asam sulfosalisilat
• Metode biuret
• Deteksi dalam urin protein Bens - Jones

Proteinuria adalah fenomena di mana protein terdeteksi dalam urin, yang menunjukkan kemungkinan kerusakan ginjal, berfungsi sebagai faktor dalam perkembangan penyakit jantung, pembuluh darah, pembuluh limfatik.

Deteksi protein dalam urin tidak selalu mengindikasikan suatu penyakit. Fenomena serupa juga terjadi pada orang yang benar-benar sehat, di mana protein urinnya dapat dideteksi. Hipotermia, aktivitas fisik, konsumsi makanan berprotein menyebabkan munculnya protein dalam urin, yang menghilang tanpa pengobatan apa pun.

Pada saat skrining, 17% orang sehat menentukan protein, tetapi hanya 2% dari jumlah orang ini menunjukkan hasil tes positif sebagai tanda penyakit ginjal.

Molekul protein tidak boleh masuk ke dalam darah. Mereka sangat penting bagi tubuh - mereka adalah bahan bangunan untuk sel, berpartisipasi dalam reaksi seperti koenzim, hormon, antibodi. Pada pria dan wanita, angka ini adalah tidak adanya protein dalam urin.

Fungsi mencegah hilangnya molekul protein oleh tubuh dilakukan oleh ginjal.

Dua sistem ginjal terlibat dalam menyaring urin:

1. glomeruli - jangan biarkan dalam molekul besar, tetapi jangan memegang albumin, globulin - sebagian kecil dari molekul protein;
2. tubulus ginjal - menyerap protein yang disaring glomeruli, kembali ke sistem peredaran darah.

Albumin (sekitar 49%), mucoprotein, globulin ditemukan dalam urin, di mana bagian imunoglobulin menyumbang sekitar 20%.

Globulin - protein whey dalam berat molekul tinggi, yang diproduksi dalam sistem kekebalan dan hati. Kebanyakan dari mereka disintesis oleh sistem kekebalan tubuh, mengacu pada imunoglobulin atau antibodi.

Albumin adalah sebagian kecil dari protein yang pertama kali muncul di urin bahkan dengan kerusakan ginjal ringan. Ada sejumlah albumin dalam urin sehat, tetapi sangat tidak signifikan sehingga tidak dapat dideteksi menggunakan diagnostik laboratorium.

Ambang batas bawah yang dapat dideteksi menggunakan diagnostik laboratorium adalah 0,033 g / l. Jika lebih dari 150 mg protein hilang per hari, mereka berbicara tentang proteinuria.

Data protein urin dasar

Penyakit dengan proteinuria ringan tidak menunjukkan gejala. Secara visual, urin bebas protein tidak dapat dibedakan dari urin, di mana ada sejumlah kecil protein. Urin yang agak berbusa menjadi sudah dengan tingkat proteinuria yang tinggi.

Dimungkinkan untuk mengasumsikan ekskresi protein aktif dalam urin dengan penampilan pasien hanya dengan derajat penyakit sedang atau berat karena munculnya edema tungkai, wajah, perut.

Pada tahap awal penyakit, berikut ini mungkin merupakan tanda tidak langsung dari proteinuria:

• perubahan warna urin;
• meningkatnya kelemahan;
• kurang nafsu makan;
• mual, muntah;
• nyeri tulang;
• mengantuk, pusing;
• suhu tinggi.

Munculnya tanda-tanda tersebut tidak bisa diabaikan, terutama selama kehamilan. Ini mungkin berarti sedikit penyimpangan dari norma, dan mungkin merupakan gejala berkembangnya preeklampsia, preeklampsia.

Mengkuantifikasi kehilangan protein bukanlah tugas yang mudah, untuk mencapai gambaran yang lebih lengkap tentang kondisi pasien, beberapa tes laboratorium digunakan.

Kesulitan dalam memilih metode untuk mendeteksi kelebihan protein dalam urin dijelaskan oleh:

• konsentrasi protein rendah, yang membutuhkan instrumen presisi tinggi;
• komposisi urin, menyulitkan tugas, karena mengandung zat yang mengubah hasilnya.

Informasi terbesar disediakan oleh analisis porsi urin pagi pertama, yang dikumpulkan setelah bangun tidur.

Menjelang analisis, kondisi berikut harus dipenuhi:

• Jangan makan pedas, goreng, makanan berprotein, alkohol;
• tidak termasuk diuretik selama 48 jam;
• batasi aktivitas fisik;
• hati-hati mengikuti aturan kebersihan pribadi.

Urin pagi hari adalah yang paling informatif, karena bersifat jangka panjang di kandung kemih, kurang tergantung pada asupan makanan.

Jumlah protein dalam urin dapat dianalisis dengan porsi acak, yang diambil setiap saat, tetapi analisis ini kurang informatif, semakin tinggi kemungkinan kesalahan.

Untuk menghitung kehilangan protein setiap hari, dilakukan analisis total urin harian. Untuk melakukan ini, dalam 24 jam dikumpulkan dalam wadah plastik khusus semua urin dialokasikan untuk hari itu. Anda dapat mulai mengumpulkan kapan saja. Kondisi utama - tepatnya hari pengumpulan.

Definisi kualitatif proteinuria didasarkan pada denaturasi protein oleh faktor fisik atau kimia. Metode kualitatif terkait dengan skrining, yang memungkinkan untuk menentukan keberadaan protein dalam urin, tetapi tidak memberikan kesempatan untuk secara akurat menilai tingkat proteinuria.

Sampel yang digunakan:

• dengan mendidih;
• asam sulfosalisilat;
• asam nitrat, reagen Larionic pada sampel cincin Heller.

Sampel dengan asam sulfosalisilat dilakukan dengan membandingkan sampel urin kontrol dengan yang berpengalaman, di mana 7-8 tetes asam sulfosalisilat 20% ditambahkan ke urin. Kesimpulan tentang keberadaan protein dibuat sesuai dengan intensitas kekeruhan opalescent yang muncul dalam tabung reaksi selama reaksi.

Tes Geller yang lebih umum digunakan menggunakan asam nitrat 50%. Sensitivitas metode ini adalah 0,033 g / l. Dengan konsentrasi protein sedemikian dalam tabung reaksi dengan sampel urin dan reagen selama 2-3 menit setelah dimulainya percobaan, cincin benang putih muncul, formasi yang menunjukkan adanya protein.

Metode semi-kuantitatif meliputi:

• metode untuk menentukan protein dalam strip tes urin;
• Metode Brandberg-Roberts-Stolnikov.

Metode penentuan menurut metode Brandberg-Roberts-Stolnikov didasarkan pada metode cincin Geller, tetapi memungkinkan seseorang untuk lebih akurat memperkirakan jumlah protein. Saat melakukan tes menggunakan teknik ini, beberapa pengenceran urin mencapai tampilan cincin protein seperti benang dalam interval waktu antara 2-3 menit dari awal tes.

Dalam prakteknya, metode strip tes digunakan dengan pewarna bromophenol biru yang digunakan sebagai indikator. Kerugian dari strip tes adalah kepekaan selektif terhadap albumin, yang mengarah pada distorsi hasil dalam kasus peningkatan konsentrasi urin globulin atau protein lainnya.

Kelemahan dari metode ini adalah sensitivitas tes yang relatif rendah terhadap protein. Strip uji mulai merespons keberadaan protein dalam urin dengan konsentrasi protein lebih besar dari 0,15 g / l.

Metode penilaian kuantitatif dapat dibagi secara kondisional menjadi:

Metode didasarkan pada sifat protein untuk mengurangi kelarutan di bawah aksi zat pengikat dengan pembentukan senyawa yang larut dalam air.

Agen yang menyebabkan pengikatan protein, bisa berupa:

• asam sulfosalisilat;
• asam trikloroasetat;
• benzethonium chloride.

Pada hasil tes, kesimpulan diambil berdasarkan tingkat atenuasi fluks cahaya dalam sampel dengan suspensi dibandingkan dengan kontrol. Hasil dari metode ini tidak selalu dapat dikaitkan dengan keandalan karena perbedaan kondisi: kecepatan pencampuran reaktan, suhu, keasaman medium.

Efek pada evaluasi asupan obat sehari sebelumnya, sebelum melakukan tes menggunakan metode ini, tidak dapat diambil:

• antibiotik;
• sulfonamid;
• obat yang mengandung yodium.

Metode ini mengacu pada biaya yang tersedia, yang memungkinkannya digunakan secara luas untuk penyaringan. Tetapi hasil yang lebih akurat dapat diperoleh dengan menggunakan teknik kolorimetri yang lebih mahal.

Metode sensitif yang secara akurat menentukan konsentrasi protein dalam urin termasuk metode kolorimetri.

Anda dapat melakukannya dengan presisi tinggi:

• reaksi biuret;
• teknik Lowry;
• Teknik pewarnaan yang menggunakan pewarna yang membentuk kompleks dengan protein urin yang berbeda dari sampel secara visual.

Metode kolorimetri untuk mendeteksi protein dalam urin

Metode ini mengacu pada yang andal, sangat sensitif, memungkinkan untuk menentukan dalam albumin urin, globulin, paraprotein. Ini digunakan sebagai metode utama untuk mengklarifikasi hasil tes kontroversial, serta protein urin harian pada pasien dengan departemen nefrologi rumah sakit.

Hasil yang lebih akurat dapat dicapai dengan metode Lowry, yang didasarkan pada reaksi biuret, serta reaksi Folin, yang mengenali triptofan dan tirosin dalam molekul protein.

Untuk menghilangkan kemungkinan kesalahan, sampel urin dimurnikan dengan dialisis dari asam amino, asam urat. Kesalahan dimungkinkan saat menggunakan salisilat, tetrasiklin, klorpromazin.

Metode yang paling akurat untuk menentukan protein didasarkan pada propertinya untuk mengikat pewarna yang digunakan:

• ponceau;
• Coomassie biru cemerlang;
• merah pirogalik.

Pada siang hari, jumlah protein yang diekskresikan dalam urin bervariasi. Untuk lebih objektif menilai kehilangan protein dalam urin, perkenalkan konsep protein harian dalam urin. Nilai ini diukur dalam g / hari.

Untuk penilaian cepat protein harian dalam urin, jumlah protein dan kreatinin ditentukan dalam satu porsi urin, kemudian rasio protein / kreatinin diambil dari kehilangan protein per hari.

Metode ini didasarkan pada fakta bahwa tingkat ekskresi kreatinin urin konstan, tidak berubah pada siang hari. Pada orang yang sehat, rasio normal protein: kreatinin dalam urin adalah 0,2.

Metode ini menghilangkan kemungkinan kesalahan yang mungkin terjadi saat mengumpulkan urin setiap hari.

Tes kualitatif lebih sering daripada tes kuantitatif memberikan hasil positif palsu atau negatif palsu. Kesalahan muncul sehubungan dengan pengobatan, kebiasaan diet, aktivitas fisik pada malam analisis.

Penguraian dari tes kualitatif ini diberikan oleh penilaian visual kekeruhan dalam tabung reaksi dibandingkan dengan hasil pengujian dengan kontrol:

1. reaksi positif yang lemah diperkirakan sebagai +;
2. positif ++;
3. +++ positif tajam.

Tes cincin Geller lebih akurat menilai keberadaan protein dalam urin, tetapi tidak memungkinkan mengukur protein dalam urin. Seperti tes asam sulfosalisilat, tes Geller hanya memberikan gambaran kasar tentang kandungan protein urin.

Metode ini memungkinkan untuk menilai tingkat proteinuria secara kuantitatif, tetapi terlalu memakan waktu, tidak akurat, karena dengan pengenceran yang kuat, akurasi penilaian menurun.

Untuk menghitung protein, Anda perlu mengalikan tingkat pengenceran urin dengan 0, 033 g / l:

Tes tidak memerlukan kondisi khusus, prosedur ini mudah dilakukan di rumah. Untuk melakukan ini, Anda harus menurunkan strip tes ke dalam urin selama 2 menit.

Hasilnya akan dinyatakan dengan jumlah plus pada strip, yang decoding yang terkandung dalam tabel:

1. Hasil tes sesuai dengan nilai hingga 30 mg / 100 ml sesuai dengan proteinuria fisiologis.
2. Nilai pada strip uji 1+ dan 2 ++ berarti proteinuria yang signifikan.
3. Nilai 3 +++, 4 ++++ ditandai dengan proteinuria patologis yang disebabkan oleh penyakit ginjal.

Strip uji hanya dapat menentukan sekitar peningkatan protein dalam urin. Mereka tidak digunakan untuk diagnostik yang akurat, dan bahkan lebih dari itu mereka tidak bisa mengatakan apa artinya.

Jangan biarkan strip tes menilai kadar protein dalam urin pada wanita hamil. Metode penilaian yang lebih andal adalah penentuan protein dalam urin harian.

Penentuan protein urin menggunakan strip tes:

Protein harian dalam urin adalah diagnosis yang lebih akurat dari penilaian keadaan fungsional ginjal. Untuk ini, Anda perlu mengumpulkan semua urin yang dikeluarkan oleh ginjal per hari.

Kandungan protein dalam urin dapat ditemukan dengan rasio protein: kreatinin, data ditunjukkan pada tabel:

Nilai yang valid untuk rasio protein / kreatinin adalah data dalam tabel:

Dengan kehilangan lebih dari 3,5 g protein per hari, kondisinya disebut proteinuria masif.

Jika ada banyak protein dalam urin, pemeriksaan ulang diperlukan setelah 1 bulan, kemudian setelah 3 bulan, menurut hasil, yang menentukan mengapa norma dilampaui.

Penyebab peningkatan protein dalam urin adalah peningkatan produksi dalam tubuh dan pelanggaran ginjal, bedakan proteinuria:

• fisiologis - penyimpangan kecil dari norma disebabkan oleh proses fisiologis, diselesaikan secara spontan;
• patologis - perubahan disebabkan sebagai akibat dari proses patologis di ginjal atau organ tubuh lainnya, tanpa pengobatan berlanjut.

Sedikit peningkatan protein dapat diamati dengan nutrisi protein yang melimpah, luka bakar mekanis, cedera, disertai dengan peningkatan produksi imunoglobulin.

Proteinuria ringan dapat disebabkan oleh aktivitas fisik, stres psiko-emosional, atau minum obat-obatan tertentu.

Proteinuria fisiologis adalah peningkatan protein urin pada anak-anak pada hari-hari pertama setelah kelahiran. Tetapi setelah satu minggu kehidupan, kandungan protein dalam urin anak dianggap sebagai penyimpangan dari norma dan menunjukkan patologi yang berkembang.

Penyakit ginjal, penyakit infeksi juga terkadang disertai dengan munculnya protein dalam urin.

Keadaan seperti itu biasanya berhubungan dengan tingkat proteinuria ringan, merupakan fenomena sementara, cepat berlalu sendiri, tanpa memerlukan perawatan khusus.

Kondisi yang lebih parah, proteinuria parah dicatat dalam kasus:

• glomerulonefritis;
• diabetes;
• penyakit jantung;
• kanker kandung kemih;
• multiple myeloma;
• infeksi, kerusakan obat, penyakit ginjal polikistik;
• tekanan darah tinggi;
• lupus erythematosus sistemik;
• Sindrom Goodpasture.

Obstruksi usus, gagal jantung, dan hipertiroidisme dapat menyebabkan jejak protein dalam urin.

Varietas proteinuria diklasifikasikan dalam beberapa cara. Untuk penilaian kualitatif protein, seseorang dapat menggunakan klasifikasi Yaroshevsky.

Menurut sistematika Yaroshevsky, dibuat pada tahun 1971, proteinuria dibedakan:

1. ginjal - yang meliputi pelanggaran filtrasi glomerulus, pelepasan protein tubulus, kurangnya re-adsorpsi protein dalam tubulus;
2. prerenal - terjadi di luar ginjal, ekskresi hemoglobin, protein yang terjadi berlebihan dalam darah akibat multiple myeloma;
3. Postrenal - terjadi di situs saluran kemih setelah ginjal, ekskresi protein dalam penghancuran organ kemih.

Untuk penilaian kuantitatif tentang apa yang terjadi, derajat proteinuria kondisional diisolasi. Harus diingat bahwa mereka dapat dengan mudah masuk ke yang lebih berat tanpa perawatan.

Tahap proteinuria yang paling parah terjadi dengan hilangnya lebih dari 3 g protein per hari. Hilangnya protein dari 30 mg hingga 300 mg per hari sesuai dengan tahap moderat atau mikroalbumuria. Hingga 30 mg protein dalam urin harian berarti proteinuria ringan.

Norma protein dalam urin berapa?

Protein normal dalam urin praktis tidak ada (kurang dari 0,002 g / l). Namun, dalam beberapa kondisi, sejumlah kecil protein dapat muncul dalam urin pada individu yang sehat setelah menelan sejumlah besar makanan protein, sebagai hasil pendinginan, dengan stres emosional, aktivitas fisik yang lama (yang disebut marching proteinuria).

Munculnya sejumlah besar protein dalam urin (proteinuria) adalah patologi. Penyebab proteinuria dapat berupa penyakit ginjal (glomerulonefritis akut dan kronis, pielonefritis, nefropati hamil, dll.) Atau saluran kemih (radang kandung kemih, prostat, ureter). Proteinuria ginjal dapat bersifat organik (glomerulus, tubulus, dan berlebih) dan fungsional (demam proteinuria, ortostatik pada remaja, saat memberi makan bayi yang berlebihan, pada bayi baru lahir). Proteinuria fungsional tidak terkait dengan patologi ginjal. Jumlah protein harian bervariasi pada pasien mulai 0,1 hingga 3,0 g atau lebih. Komposisi protein urin ditentukan oleh elektroforesis. Penampilan dalam urin protein Bens-Jones adalah karakteristik dari myeloma dan Waldenstrom macroglobulinemia, # 223; 2 mikroglobulin jika terjadi kerusakan pada tubulus ginjal.

Protein normal dalam urin praktis tidak ada (kurang dari 0,002 g / l).

Tanda-tanda utama penyakit terdeteksi dalam studi urin.

SG Berat spesifik. Penurunan berat spesifik menunjukkan penurunan kemampuan ginjal untuk memekatkan urin dan mengeluarkan racun dari tubuh, seperti halnya dengan gagal ginjal. Peningkatan berat spesifik dikaitkan dengan sejumlah besar gula dalam urin, garam. Perlu dicatat bahwa tidak mungkin untuk mengevaluasi berat jenis hanya untuk satu tes urin, mungkin ada perubahan acak, perlu untuk melakukan analisis urin 1-2 kali.

Protein Protein dalam urin - proteinuria. Penyebab proteinuria dapat merusak ginjal itu sendiri pada nefritis, amiloidosis, dan kerusakan oleh racun. Protein dalam urin juga dapat muncul karena penyakit saluran kemih (pielonefritis, sistitis, prostatitis).

Glukosa Glukosa (gula) dalam urin - glikosuria - paling sering disebabkan oleh diabetes. Penyebab yang lebih jarang adalah kekalahan tubulus ginjal. Sangat mengganggu jika tubuh keton terdeteksi bersama dengan gula dalam urin. Ini terjadi pada diabetes yang parah dan tidak selaras dan merupakan pertanda komplikasi diabetes yang paling parah - koma diabetik.

Bilirubin, Urobilinogen Bilirubin dan urobilin ditentukan dalam urin dalam berbagai bentuk penyakit kuning.

Eritrosit Eritrosit dalam urin - hematuria. Ini terjadi baik dengan kekalahan ginjal sendiri, paling sering dengan peradangan mereka, atau pada pasien dengan penyakit pada saluran kemih. Jika, misalnya, sebuah batu bergerak di sepanjang mereka, itu bisa melukai selaput lendir, akan ada sel darah merah di urin. Tumor ginjal yang membusuk juga dapat menyebabkan hematuria.

Leukosit Leukosit dalam urin - leukositosis, paling sering merupakan akibat dari perubahan inflamasi pada saluran kemih pada pasien dengan pielonefritis, sistitis. Leukosit sering ditentukan oleh peradangan organ genital eksternal wanita, pada pria, oleh radang kelenjar prostat.

Silinder Silinder adalah struktur mikroskopis yang khas. Silinder hialin dalam jumlah 1-2 bisa pada orang yang sehat. Mereka terbentuk di tubulus ginjal, itu menempel bersama partikel protein. Namun peningkatan jumlah mereka, silinder tipe lain (granular, eritrosit, lemak) selalu menunjukkan kerusakan jaringan ginjal itu sendiri. Ada silinder dalam penyakit radang ginjal, lesi metabolisme, seperti diabetes.

Metode informatif dan batasannya. Kandungan informasi dari tes urin umum untuk mengenali penyakit-penyakit spesifik dari ginjal adalah rendah, biasanya memerlukan studi tambahan yang lebih akurat. Tetapi penelitian sangat penting, terutama ketika melakukan studi pencegahan, karena memungkinkan untuk mengidentifikasi tanda-tanda awal penyakit ginjal. Diketahui juga bahwa seringkali penyakit ginjal tersembunyi, dan hanya penelitian urin yang memungkinkan mereka untuk mencurigai dan melakukan pemeriksaan lebih lanjut yang diperlukan.

Di sebagian besar laboratorium, ketika memeriksa urine untuk protein, pertama-tama gunakan reaksi kualitatif yang tidak mendeteksi protein dalam urin orang sehat. Jika protein dalam urin terdeteksi oleh reaksi kualitatif, penentuan kuantitatif (atau semi-kuantitatif) dilakukan. Pada saat yang sama, fitur-fitur metode yang digunakan yang mencakup spektrum uroprotein yang berbeda adalah penting. Jadi, ketika menentukan protein menggunakan asam sulfosalisilat 3%, jumlah protein dianggap normal hingga 0,03 g / l, saat menggunakan metode pirogalol, batas nilai protein normal meningkat menjadi 0,1 g / l. Dalam hal ini, dalam bentuk analisis perlu untuk menunjukkan nilai normal protein untuk metode yang digunakan oleh laboratorium.

Ketika menentukan jumlah minimum protein, disarankan untuk mengulangi analisis, jika ragu, kehilangan harian protein dalam urin harus ditentukan. Urin harian normal mengandung protein dalam jumlah kecil. Dalam kondisi fisiologis, protein yang disaring hampir sepenuhnya diserap kembali oleh epitel tubulus proksimal dan kandungannya dalam jumlah urin harian bervariasi menurut penulis yang berbeda dari jejak hingga 20 50, 80 100 mg dan bahkan 150 200 mg. Beberapa penulis percaya bahwa ekskresi protein harian dalam jumlah 30 50 mg / hari adalah norma fisiologis untuk orang dewasa. Yang lain percaya bahwa ekskresi protein urin tidak boleh melebihi 60 mg / m2 permukaan tubuh per hari, tidak termasuk bulan pertama kehidupan, ketika nilai proteinuria fisiologis dapat empat kali lebih tinggi dari nilai yang ditentukan.

Kondisi umum untuk penampilan protein dalam urin orang sehat adalah konsentrasi mereka yang cukup tinggi dalam darah dan berat molekul tidak lebih dari 100.200 kDa.

ini bukan norma, dengan diagnosis Anda mungkin, hal lain adalah bahwa untuk sindrom nefrotik itu sebenarnya indikator kecil.. lihat klinik - pembengkakan, tekanan, dll., terus mengambil pengobatan yang ditentukan..

namun saya akan mengatakan: itu TIDAK normal!